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环境工程微生物学实验技术
6、培养基的灭菌
培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，0.1MPa或100kPa（与相关单位间的换算见表1-1）灭菌20min。如因特殊情况不能灭菌，则应暂存于冰箱中。
1）向锅内加水
打开灭菌锅盖，向国内加适量水（立式高压蒸汽灭菌锅从进水杯处加煮开过的水至量高水位的标示高度）。水量不足，灭菌锅易干。
2）放入待灭菌物品
将待灭菌物品放入灭菌桶内，物品不要放得太紧和紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品。
3）盖好锅盖
将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，有利于罐内冷空气子下而上排出，加盖，上下螺栓口对齐，采用对角方式均匀旋紧螺栓，使锅密闭。
4）排放锅内冷空气及升温灭菌
打开放汽阀，加热（电加热或煤气加热或直接通入蒸汽），自锅内开始产生蒸汽后3min再灌进放汽阀（或喷出气体不形成水雾），此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排尽，温度随蒸汽压力增高而上升，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时，一般培养基控制在0.1MPa灭菌20min；含糖等成分培养基控制在0.056MPa灭菌30min或0.07MPa灭菌20min，关闭热源，停止加热，压力随之逐渐降低。
5）灭菌完毕降温及后处理
待压力降至0时，慢慢打开放汽阀（排汽口），开盖，立即取出灭菌物品。但在压力未完全降至0处前，不能打开锅盖，以免培养基沸腾将棉塞冲出：也不可用冷水冲淋灭菌锅迫使温度迅速下降。所灭物品开盖后立即取出，以免凝结在锅盖和器壁上的水滴弄湿包装纸或落到被灭菌物品上，增加染菌率。斜面培养基自锅内取出后要趁热摆成斜面，灭菌后的空培养皿、试管、移液管等需烘干或晾干。
若连续使用灭菌锅，每次需补足水分；灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保持灭菌锅干燥。
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7、斜面和平板的制作 1）斜面的制作
将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面（图1-5）。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。
图1-5 斜面的放置
2）平板的制作
将装在锥形瓶瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，指瓶口正好伸入，倾入10~12ml的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板（图1-6）。
图1-6 将培养基倒入培养皿内
8、培养基的无菌检查
灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1~2管（瓶），至于37℃温箱中培养1~2d，确定无菌后方可使用。
9、无菌水的制备
在每个250ml的锥形瓶内装99ml的蒸馏水并塞上棉塞。在每支试管内装4.5ml蒸馏水。塞上棉塞或盖上塑料试管盖。再在棉塞上包上一张牛皮纸。高压蒸汽灭菌，0.1MPa灭菌20min。
10、接种技术
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1）接种环（或针）每次使用前后均应在火焰上彻底灼烧灭菌如图1-7所示。挑菌前，必须待接种环（或针）冷却后挑取，也可把接种环（或针）先碰一下旁边的琼脂，使之冷却，然后挑取菌种。带菌的接种环（或针）必须充分灼烧灭菌后才可放在桌上。
图1-7 接种技术示意图（a）接种环灭菌
2）左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一只为已长好的菌种。右手拿接种环（已在火焰上灼烧，又冷却），并同时用右手轻轻拔下两支试管的棉塞（或试管帽）如图1-8。
3）将试管口通过火焰数次，并稍转动，开塞后试管不可直立，只可斜的或平行在火焰旁如图的位置，以防止外界的污染。如图1-9。
4）首先将接种环伸入有菌试管，使接种环接触菌苔取少量菌，取出接种环，迅速伸入另一只灭菌斜面上并在斜面上轻轻涂过。如图示。此步先需注意接种环不可碰试管壁和接种时不要划破培养基。如图1-10。
5）烧试管口，塞好棉塞或盖好试管帽，将接种环放到火焰上灼烧，烧去多余的菌种如图1-11。
图1-8 接种技术示意图（b）
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图1-9 接种技术示意图（c）
图1-10 接种技术示意图（d） 图1-11 接种技术示意图 （e）(f)
三、实验设备与材料
1、药品 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，水，1mol/LNaOH溶液、1mol/L HCl溶液
2、仪器 天平或台秤，高压蒸汽灭菌锅
3、玻璃器皿 移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等 4、其他物品 药匙、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等 四、实验基本要求
1、实验课前需对实验内容进行预习。
2、实验过程中对高压灭菌锅、超净台、酒精灯的使用要注意安全。 3、了解高压灭菌操作步骤及注意点。
4、实验过程中要注意记录实验现象，并在实验报告中有所体现。 五、实验报告要求
1、结合本教材及实验课所学内容，写出实验报告。
2、实验报告内容包括实验原理、实验目的、实验器材、实验步骤、结果讨
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