发布时间 : 星期日 文章分子实验中核算DNA提取常见问题及分析更新完毕开始阅读
RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，需在溶液P1中添加RNaseA。 3．混有基因组DNA
加入溶液P2和P3后应温和温匀,如果剧烈振荡,可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中,如果加入溶液P2后过于粘稠,无法温和温匀,请减少菌体用量.细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,培养时间不要超过16小时。 4．P3溶液加入时间过长
P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。 5．含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5 a 和Top10。 6．质粒的二聚体和多聚体形式
质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。 六、RNA降解 1．新鲜细胞：
如果试剂没有问题，外源性污染也可以排除的话，降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养血中裂解细胞的话,一定要使裂解液能覆盖住细胞。 2．新鲜组织：
某些富含内源核酸酶的样品（如肝脏，胸腺等），即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 3．冷冻样品：
样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。 4．外源RNA酶的污染：
试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。 5．内源RNA酶的污染：
抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。 七、OD 260 / OD 280 比值偏低 1．蛋白质污染：
确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氮仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD 260 / OD 280比值偏低,则用氮仿重新抽提一次,再沉淀,溶解． 2．苯酚残留：
确保不要吸入中间层及有机相。加入氮仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
3．多糖或多酚的残留：
一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。 4．设备限制：
测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间.此范围线性最好.用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10mM Tris,PH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。