发布时间 : 星期一 文章分子生物学实验指导(精)更新完毕开始阅读
的电泳图谱，一般DNA 用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA 加1 单位酶，消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
[实验仪器与设备]
水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液器，微波炉，紫外透射仪，照相系统
[实验材料]
λDNA; 重组pUC19 质粒; EcoR I 酶及其酶切缓冲液; Hind Ⅲ酶及其酶切缓冲液;琼脂糖(Agarose)。
附试剂的配制：
1、 5×TBE 电泳缓冲液：见实验二。 2、 6×加样缓冲液：见实验二。 3、 溴化乙锭：见实验二。
[实验步骤]
1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管编号，用微量移液枪分别加入1μg DNA 和相应的限制性内切酶，10×缓冲液2μL，再加入重蒸水使总体积为19μL，将管内溶液混匀后加入1μL 酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。
2. 混匀反应体系后，将eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2-3 小时，使酶切反应完全。
3.每管加入2μL 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀,以停止反应，置于冰箱中保存备用。
4.制备琼脂糖凝胶分析内切酶酶切反应结果
配制1.5%琼脂糖凝胶，取10μL 酶解液与2μL 6×加样液混匀电泳。保持电压在60-80V，电流在40mA.电泳结束后，用EB染色20-25min，紫外灯下观察结果。
[作业]
根据紫外灯下观察的结果，画出电泳示意图，并讨论内切酶酶切反应的注意事项。
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实验七 E. coli感受态细胞的制备 实验七八 DNA连接、转化及重组鉴定
[实验目的]
通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术 [实验原理]
细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体
构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Amp等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
[实验仪器与设备]
1．超净工作台 2.低温离心机 3. 恒温摇床 4. 恒温箱 5. -70℃ 6. 恒温水浴器
[实验材料]
1.氯化钙(CaCl2) 2.胰蛋白胨 3.酵母提取物 4.氯化钠(NaCl) 5.氨苄青霉素 6.大肠杆菌DH5α 7.pUC19质粒 8. 50mL离心管 9.吸头、培养皿、锥形瓶等
附试剂的配制：
1. 0.1mol/L CaCl2溶液 2. LB液体培养基
配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入： 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g
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摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积1L，湿热灭菌。
3．氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。
[实验步骤]
1．从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取0.5 mL菌液转接到一个含有50mL LB液体培养基锥形瓶中, 37℃振荡培养2-3h.
3.将菌液转移到50 mL离心管中，冰上放置10min. 4.离心10min(4000rpm)，回收细胞.
5.倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽.
6.用冰冷的0.1mol/L CaCl210mL悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。 7．0-4℃ 6000rpm，离心10min，回收细胞。 8．用冰冷的0.1mol/L CaCl22mL悬浮细胞 。
9．分装细胞，每200μL一份。此细胞为感受态细胞。
10．取200μL新鲜配制的感受态细胞，加入DNA 2μL（50ng）混匀，冰上放置30min。
同时做两个对照管：
受体菌对照：200μL感受态细胞+2μL无菌水
质粒对照：200μL 0.1mol/L CaCl2溶液+2μL质粒DNA溶液 11．将管放到42℃循环水浴1-2min。 12．冰浴2min.
13．每管加800μL LB液体培养基，37℃培养1h。
14．将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的固体培养基上。 15．倒置平皿37℃培养12-16h，出现菌落。
[作业]
观察在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长的菌落生长情况，并分析原因。
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